Dag 4

Stringenstvätt och detektion

Elektrofores med oklyvd plasmid samta två koncentrationer plasmid klyvd med Eco R1.

1. Oklyvd plasmid. Går att storleksbestämma på grund av supercoil strukturen.

2. Klyvd plasmid (0,5 µg). Insert är mindre och har vandrat längst (nederst) och vektorn är större och har vandrat kortare (överst)

3. Klyvd plasmid (0,005 µg). Inget synligt band förmodligen pga den låga koncentrationen.

4. Markör III

5. Markör VI

 

Southern blot.

1. Oklyvd plasmid. Flera band förmodligen pga att plasmiderna har olika struktur (supercoiled, open cirkular och linjär). Eftersom det är fler än 3 band har kanske proben bundit ospecifikt pga för låg stringens.

2. Klyvd plasmid (0,5 µg). Det kraftiga bandet är troligt att det är LL37. Vad det övriga 'r vet jag inte men kanske rester av plasmiden där proben bundigt ospecifikt eller att plasmiden inte klyvt fullständigt och vissa har kvar sitt insert vilket gör att proben även binder där?

3. Klyvd plasmid (0,005 µg). Här kan man se ett band vilket man inte kunde efter elektroforesen vilket tyder på att metoden är känsligare. Dock har bandet vandrat längre vilket inte var väntat. Vad det beror på vet vi inte men en teori är att spädningen kan påverka struktur eller laddning som i sin tur påverkar hur molekylerna vandrar.

4. Markör III. Inga band förväntades eftersom de inte innehåller LL37.

5. Markör VI.  Inga band förväntades eftersom de inte innehåller LL37.

 

Jämförelse mellan PCR och southern blot.

PCR var myclet lättare att arbeta med och innehöll färre moment att utföra och gick snabbare. Nackdelen var att det var större risk för carry-over-kontamination men detta kunde uteslutas med kontroller. Den kräver också väldigt lite prov.

Southern blot var mer känslig och kan således detektera mindre koncentarationer. Nackdelen är att den innehåller många steg och således många faktorer som kan påverka detektionen.

Det viktigaste jag lärt mig

Förberedelsen av uppgiften gav insikt i hur mycket förberedelser det krävs för att utföra en laboration. Erfarenhet erhölls i de olika metoderna men framför allt vana att laborera som tex att pipettera, gjuta geler, använda apparatur mm. Jag tycker att det finns för lite övning på denna utbildning hur man ska räkna på spädningar och det fick vi öva på nu!

Dag 2

PCR-reaktion för kontroll av insert
Kontrollelektrofores för PCR-reaktion och plasmidprep

Hur blev resultatet från PCR? Vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?
PCR-reaktionen blev lyckad och PCR-produkten är troligen amplifiikat av större delen av LL37-genen. Amplifikatet har kontrollerats med elektrofores tillsammas med positiv och negativ kontroll, okluven plasmid samt markör III och VI och följande resultat erhölls.



Band 1-6 från vänster till höger:

1. Eget prov. Ett band tyder på att vi inte har ospecifika produkter dvs primrarna har bundit till målområdet som tänkt. Markörerna blev väldigt svaga så det var inte helt lätt att jämföra men den egna produkten borde ligga runt 550 bp som förväntat.

2. Den negativa kontrollen uppvisade inget band vilket tyder på att kontaminering av DNA och där med amplifiering inte har skett. Ett litet suddigt band av molekyler som vandrat väldigt långt dvs är mycket små kan skönjas. Detta är förmodligen oförbrukade primrar.

3. Den positiva kontrollen behövdes inte i detta fall eftersom vi hade amplifiering i det egna provet men kunde användas som markör i detta fall. Den positiva kontrollens band var precis i samma höjd och av samma intensitet som egna provet vilket tyder på att egna prover verkligen var LL37.

4. Ett tjockt band från plasmiden syns. Plasmiden kan dock inte storleksbestämmas med marköreren eftersom den inte är linjär utan supercoiled. Detta band är tjockast och kan tolkas som att det mesta av plasmiden har denna form. Det finns ett tunnare band som inte vandrat lika långt vilket förmodligen är en plasmid där en sträng gått sönder och supercoilstrukturen tvinnats upp och bildat en sk open cirkular struktur. Det Skulle ytterligare ett band synas skulle det kunna vara en plasmid med båda stängarna brutna och molekylen blivit linjär. Om det funnits föroreningar av kromosomalt DNA eller RNA skulle det ha synliggjorts i fragemnt som vandrat mycket kort resp. mycket långt.

5. Markör III

6. Markör VI

Dag 1

Rening av rekombinant plasmid från suspention av transformerade E. coli.

Vilka föroreningar har vi tvättat bort?
Det första steget i reningsprocessen är alkalisk denaturering. Genom att tillsätta 3 olika färdiga buffertar (P1, P2 och N3) från Qiagen miniprep och med hjälp av centrifugering kunde vi separera kromosomalt DNA och proteiner från plasmiden.

P1 innehåller bl.a. Tris och EDTA som bidrar till uppluckring av bakteriernas cellvägg RNas som klyver RNA till mindre fragment. P2 innehåller bl.a. SDS som bryter cellmembranet samt NaOH vilket höjer Ph-värdet kraftigt och DNA och proteinerna denatureras. Vätebindningar na mellan DNA-strängarna bryts och vi får enkelsträngat DNA. N3 innhåller kaliumacetet vilket neutraliserar pH-värdet och vätebindnigarna mellan enkelsträngat DNA återbildas. Pga plasmidens supercilstruktur basparar strängarna som tidigare medan det kromosomala DNAt som dissosierat från varandra basparar hur som helst men andra stärngar och vi får en vit fällning (tillsammans med proteiner).

Det andra steget i är rening på glasfiberkolonn. Genom att applicera vårt delvis renade prov på ett silicamembran i närvaro av chaoropiskt salt kommer all nuklinsyra samt proteinreter att binda till membranet. Nukleinnsyran med sin supercilstruktur har många negativa laddningar och binder hårdast till membranet. Genom att tvätta membranet med gradvis sänkning av salthalten kommer molekyler som t.ex. RNA och mindre proteiner som inte binder lika hårt till membranet som DNA att lossna.

Blev resultatet ren plasmid?
Utifrån absorbansen vid 260 nm kunde vi räkna ut koncentrationen på vår fragmrenade plasmid till 2,80 mikrog / mikroliter. Är detta mycket eller lite?

Genom att räkna ut kvoten mellan A260/A280 som i vårt fall blev 1,75 kunde vi dra slutsatsen att vi inte har mycket protinföroreningar då rent DNA ger en kvot på 1,8. Detta betyder dock inte att det inte kan finnas andra föroreningar. En elektrofores skulle kunna avslöja om vi har annat DNA eller RNA kvar i provet.

Funderingar
Vad var syftet med LyseBlue och varför blev det inte blått?
Vilken koncentration bör plasmidprepen ha för att kunna utföra fortsatta försök?