Dag 1
Rening av rekombinant plasmid från suspention av transformerade E. coli.
Vilka föroreningar har vi tvättat bort?
Det första steget i reningsprocessen är alkalisk denaturering. Genom att tillsätta 3 olika färdiga buffertar (P1, P2 och N3) från Qiagen miniprep och med hjälp av centrifugering kunde vi separera kromosomalt DNA och proteiner från plasmiden.
P1 innehåller bl.a. Tris och EDTA som bidrar till uppluckring av bakteriernas cellvägg RNas som klyver RNA till mindre fragment. P2 innehåller bl.a. SDS som bryter cellmembranet samt NaOH vilket höjer Ph-värdet kraftigt och DNA och proteinerna denatureras. Vätebindningar na mellan DNA-strängarna bryts och vi får enkelsträngat DNA. N3 innhåller kaliumacetet vilket neutraliserar pH-värdet och vätebindnigarna mellan enkelsträngat DNA återbildas. Pga plasmidens supercilstruktur basparar strängarna som tidigare medan det kromosomala DNAt som dissosierat från varandra basparar hur som helst men andra stärngar och vi får en vit fällning (tillsammans med proteiner).
Det andra steget i är rening på glasfiberkolonn. Genom att applicera vårt delvis renade prov på ett silicamembran i närvaro av chaoropiskt salt kommer all nuklinsyra samt proteinreter att binda till membranet. Nukleinnsyran med sin supercilstruktur har många negativa laddningar och binder hårdast till membranet. Genom att tvätta membranet med gradvis sänkning av salthalten kommer molekyler som t.ex. RNA och mindre proteiner som inte binder lika hårt till membranet som DNA att lossna.
Blev resultatet ren plasmid?
Utifrån absorbansen vid 260 nm kunde vi räkna ut koncentrationen på vår fragmrenade plasmid till 2,80 mikrog / mikroliter. Är detta mycket eller lite?
Genom att räkna ut kvoten mellan A260/A280 som i vårt fall blev 1,75 kunde vi dra slutsatsen att vi inte har mycket protinföroreningar då rent DNA ger en kvot på 1,8. Detta betyder dock inte att det inte kan finnas andra föroreningar. En elektrofores skulle kunna avslöja om vi har annat DNA eller RNA kvar i provet.
Funderingar
Vad var syftet med LyseBlue och varför blev det inte blått?
Vilken koncentration bör plasmidprepen ha för att kunna utföra fortsatta försök?
Det är bra att du skrev om i vilka steg de olika föroreningarna tvättades bort, och även att du förklarade hur det går till.
SvaraRaderaVad händer om man har proteinföroreningar i sitt prov, som du skriver, hur mycket föroreningar är okej? Superbra skrivet! :)
SvaraRadera/Sarah
Jag räknade ut fel koncentration på den renade plasmiden, den ska vara 0,28 mikrog/mikrol.
SvaraRaderaHej Anna,
SvaraRaderaDu beskriver mycket bra och tydligt principen för plasmidreningen. Det var i och för sig inget ni behövde göra.
Bra att du korrigerade koncentrationen.
Med denna plasmid och den volym ni utgick ifrån så brukar koncentrationen ligga runt 0,3-0,5 mikrog/mikroliter. Det innebär ett utbyte på i storleksordningen 20 mikrogram vilket mycket material att jobba vidare med.
Vitsen med LyseBlue, som är en pH indikator, är att se att man först får ett basiskt pH (blått) och att sedan en neutralisering i hela lösningen(ofärgat). Varför ni inte såg det vet jag inte eftersom det medföljande lyseblue var tillsatt.
Annica
Mycket bra skrivet! Skulle dock vara skönt om det vore lite mer sammanfattat, hehe ;) Vad kan man säga om kvoten av A260/A280 som i erat fall blev 1,75? Fick ni kontaminering eller inte?
SvaraRadera