Dag 4

Stringenstvätt och detektion

Elektrofores med oklyvd plasmid samta två koncentrationer plasmid klyvd med Eco R1.

1. Oklyvd plasmid. Går att storleksbestämma på grund av supercoil strukturen.

2. Klyvd plasmid (0,5 µg). Insert är mindre och har vandrat längst (nederst) och vektorn är större och har vandrat kortare (överst)

3. Klyvd plasmid (0,005 µg). Inget synligt band förmodligen pga den låga koncentrationen.

4. Markör III

5. Markör VI

 

Southern blot.

1. Oklyvd plasmid. Flera band förmodligen pga att plasmiderna har olika struktur (supercoiled, open cirkular och linjär). Eftersom det är fler än 3 band har kanske proben bundit ospecifikt pga för låg stringens.

2. Klyvd plasmid (0,5 µg). Det kraftiga bandet är troligt att det är LL37. Vad det övriga 'r vet jag inte men kanske rester av plasmiden där proben bundigt ospecifikt eller att plasmiden inte klyvt fullständigt och vissa har kvar sitt insert vilket gör att proben även binder där?

3. Klyvd plasmid (0,005 µg). Här kan man se ett band vilket man inte kunde efter elektroforesen vilket tyder på att metoden är känsligare. Dock har bandet vandrat längre vilket inte var väntat. Vad det beror på vet vi inte men en teori är att spädningen kan påverka struktur eller laddning som i sin tur påverkar hur molekylerna vandrar.

4. Markör III. Inga band förväntades eftersom de inte innehåller LL37.

5. Markör VI.  Inga band förväntades eftersom de inte innehåller LL37.

 

Jämförelse mellan PCR och southern blot.

PCR var myclet lättare att arbeta med och innehöll färre moment att utföra och gick snabbare. Nackdelen var att det var större risk för carry-over-kontamination men detta kunde uteslutas med kontroller. Den kräver också väldigt lite prov.

Southern blot var mer känslig och kan således detektera mindre koncentarationer. Nackdelen är att den innehåller många steg och således många faktorer som kan påverka detektionen.

Det viktigaste jag lärt mig

Förberedelsen av uppgiften gav insikt i hur mycket förberedelser det krävs för att utföra en laboration. Erfarenhet erhölls i de olika metoderna men framför allt vana att laborera som tex att pipettera, gjuta geler, använda apparatur mm. Jag tycker att det finns för lite övning på denna utbildning hur man ska räkna på spädningar och det fick vi öva på nu!