Dag 2

PCR-reaktion för kontroll av insert
Kontrollelektrofores för PCR-reaktion och plasmidprep

Hur blev resultatet från PCR? Vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?
PCR-reaktionen blev lyckad och PCR-produkten är troligen amplifiikat av större delen av LL37-genen. Amplifikatet har kontrollerats med elektrofores tillsammas med positiv och negativ kontroll, okluven plasmid samt markör III och VI och följande resultat erhölls.



Band 1-6 från vänster till höger:

1. Eget prov. Ett band tyder på att vi inte har ospecifika produkter dvs primrarna har bundit till målområdet som tänkt. Markörerna blev väldigt svaga så det var inte helt lätt att jämföra men den egna produkten borde ligga runt 550 bp som förväntat.

2. Den negativa kontrollen uppvisade inget band vilket tyder på att kontaminering av DNA och där med amplifiering inte har skett. Ett litet suddigt band av molekyler som vandrat väldigt långt dvs är mycket små kan skönjas. Detta är förmodligen oförbrukade primrar.

3. Den positiva kontrollen behövdes inte i detta fall eftersom vi hade amplifiering i det egna provet men kunde användas som markör i detta fall. Den positiva kontrollens band var precis i samma höjd och av samma intensitet som egna provet vilket tyder på att egna prover verkligen var LL37.

4. Ett tjockt band från plasmiden syns. Plasmiden kan dock inte storleksbestämmas med marköreren eftersom den inte är linjär utan supercoiled. Detta band är tjockast och kan tolkas som att det mesta av plasmiden har denna form. Det finns ett tunnare band som inte vandrat lika långt vilket förmodligen är en plasmid där en sträng gått sönder och supercoilstrukturen tvinnats upp och bildat en sk open cirkular struktur. Det Skulle ytterligare ett band synas skulle det kunna vara en plasmid med båda stängarna brutna och molekylen blivit linjär. Om det funnits föroreningar av kromosomalt DNA eller RNA skulle det ha synliggjorts i fragemnt som vandrat mycket kort resp. mycket långt.

5. Markör III

6. Markör VI